Μάθημα Επιλογής: Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας

SOS
* Που χρησιμοποιείται η RFLP;
* Ποια η κύρια διαφορά των παραλλαγών PCR με την PCR;
* Γιατί η Nested PCR επιτυγχάνει αυξημένη ειδικότητα;
* Ποια τεχνική θα χρησιμοποιήσετε για ανίχνευση σε ποια κύτταρα εκφράζεται ένα γονίδιο;
* Ποια τεχνική θα χρησιμοποιήσουμε για την έκφραση 5 διαφορετικών γονιδίων ταυτόχρονα; Απάντηση: Multiplex/RT-PCR
* Ποια τεχνική θα χρησιμοποιήσουμε για την ποσοτική έκφραση RNA ιού; Απάντηση: Real-Time PCR/RT-PCR



* Άσκηση 1:
Δείγματα DNA 5 μολυσμένων ζώων τρέχουν σε πηκτή αγαρόζης. Στο πρώτο πηγαδάκι εμφανίζονται 3 μπάντες, στο δεύτερο 2, στο τρίτο 2, στο τέταρτο 1 και στο τελευταίο καμία. Επίσης δίνεται η πληροφορία ότι τα 3 βακτήρια Helicobacter billis, H. Canis και H. felis κόβονται με ενδονουκλεάσες και δίνουν 3 τμήματα (180,360,250), 2 τμήματα (180, 610) και 2 τμήματα (540, 250) αντίστοιχα. Να βρεθεί ποιο ζώο είναι μολυσμένο από ποιο βακτήριο.


Απάντηση: Το πρώτο ζώο είναι μολυσμένο από το H. Billis γιατί έχει 3 μπάντες.

Το δεύτερο και τρίτο είναι μολυσμένα με τα H. Canis και H. felis γιατί έχουν δύο μπάντες και ο περαιτέρω διαχωρισμός τους γίνεται ανάλογα με τις μπάντες που θα βρίσκονται στο σχηματογράφημα. Το τέταρτο ζώο που έδωσε μια μπάντα περίπου στις 800 βάσεις θεωρούμε ότι είναι άλλο είδος Helicobacter.

Το πέμπτο είναι αρνητικό.


* Άσκηση 2:
Σε κάποια περιοχή εμφανίζεται ένα νόσημα με κλινικά συμπτώματα και παθολογοανατομικά ευρήματα που μοιάζουν με εκείνα του καταρροϊκού πυρετού του προβάτου.

Τέσσερα δείγματα βρέθηκαν ύποπτα.

Ορολογικά βρέθηκαν τέσσερα θετικά για τον συγκεκριμένο ιό.

Επιβεβαίωση με PCR με ειδικούς εκκινητές. Το μέγεθος του γονιδίου είναι 400 βάσεις.

Κάνω ηλεκτροφόρηση. Το αποτέλεσμα βρίσκεται στη σελίδα 36 (Ακριβώς πριν αρχίσει η περιγραφή της Multiplex PCR). Η πρώτη διαφάνεια της σελίδας έχει ένα σχηματογράφημα από ηλεκτροφόρηση.

α) Έχει πρόβλημα η PCR, εξηγείστε;

β) Αν ναι, τι θα κάνουμε εναλλακτικά και γιατί;


Απάντηση: α) Ναι έχει πρόβλημα, γιατί ενώ περιμένουμε μπάντα ή στις 400 βάσεις ή τίποτα, εμφανίζονται μπάντες στις 400 βάσεις που αχνοφαίνονται και στις 200 που είναι έντονες.

β) Θα κάνουμε την Nested-PCR.

i) Έχει αυξημένη ειδικότητα (έχω μη ειδικό προϊόν στις 200 βάσεις).

ii) Έχει αυξημένη ευαισθησία (οι μπάντες στις 400 βάσεις αχνοφαίνονται).


* Άσκηση 3:
Βλέπε σελ. 55 πρώτη διαφάνεια (η επόμενη από τη διαφάνεια που λέει εφαρμογές της Real-Time PCR).

1. α) Το δείγμα Νο1 ή Νο3 έχει μεγαλύτερη αρχική συγκέντρωση;

β) Τα αποτελέσματα ποιάς τεχνικής πήρατε για να το δικαιολογήσετε;

2. Ποιά από τις δύο τεχνικές είναι πιο ευαίσθητη;



Απάντηση: 1. α) Το Νο 1 γιατί έχει 12 ενώ το Νο3 έχει περίπου 20.

β) Με την Real-Time PCR και όχι με την κλασσική λόγω του ότι η πρώτη κάνει ποσοτικό προσδιορισμό.

2. Η Real-Time PCR γιατί το Νο6 και Νο7 είναι ανιχνεύσιμα στην τεχνική αυτή, σε αντίθεση με την κλασσική που δεν ανιχνεύονται.

πηγή: Geo